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气相液氮运输罐短期储存胚胎的可行性研究材料和方法(上)

作者:天驰液氮罐 来源:原创 日期:2013-11-08 11:09:24 人气:11 加入收藏 标签:液氮运输罐

气相液氮运输罐短期储存胚胎的可行性研究材料和方法(上)

1.1动物
B10A、C57BL/6、DBA/2、B6D2,均由中科院上海实验动物中心提供。雄鼠为8周龄、雌鼠为4周龄。另外胚胎移植受体使用lO周ICR雌鼠【SCXK(沪)2007.o005】。实验严格遵守SPF级标准要求[SYXK(沪)2007.0005】。

1.2主要仪器
MⅦXC47/11一lO型液相液氮罐,MⅥZ SC4/3V型气相液氮运输罐,Heraeus C02培养箱,NikonSMZ.10实体显微镜等。

1.3培养基的准备


体外受精液:HTF(表1);胚胎冷冻液:DMsO(Si舀m D2650)DAP213(DMSO:A七etaITlide:P玎叩yleneglycol=2:1:3);石蜡油:(Sigma M8410)。在体外授精前1 d,准备好精子获能和体外授精的培养液滴(200“1),上面覆盖经胚胎测试过的石蜡油,放入37℃,5%Co:的培养箱里隔夜平衡。

1.4气相液氮运输罐的准备在使用前1 d先将液氮冲入气相液氮运输罐到罐体的一半,放置5 h,降低罐内温度。然后再将液氮充满,使液氮吸附剂充分吸附液氮,放置24 h后,将多余的液氮倒出后待用。

1.5体外授精
取4周龄的小鼠,在体外授精前3 d的20:oo,每只腹腔注射PMSG 5IU,48 h后,再每只腹腔注射hCG 5IU。注射hCG后约13 h处死小鼠,打开腹腔,迅速分离输卵管,在滤纸上除去血迹后放入培养皿的石蜡油中,用解剖针挑破输卵管膨大部,卵子自然流出,用解剖针将卵子团引入到隔夜平衡的200 m H1F受精液滴中。在雌鼠注射hCG约12 h后用颈椎脱臼的方法处死雄鼠,打开腹腔,迅速分离附睾尾和输精管,尽可能除去黏附在附睾尾的脂肪和血迹。用手指捏住附睾尾,用眼科剪在其上部切开,用解剖针挑取精子放入隔夜平衡的200 ulHTF受精液滴里,培养1~1.5 h。将培养l h的精子悬浮液在显微镜‘卜.观察活力和数量后,每个受精液滴加入10 L‘l获能的精子。第二天早上洗卵,对2.细胞的胚胎进行计数。


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